Откривателят на PCR — секс, наркотици и… Нобел

Новини
20:35 - 31 Март 2020
5278
Откривателят на PCR — секс, наркотици и… Нобел

От две седмица абревиатурата PCR не слиза от устата на малки и големи. Покрай пандемията от коронавирус всички говорят за PCR тестове, но малцина имат представа какво представлява технологията, а още по-малко знаят кой е човекът, който я е изобретил. А това се случва сравнително неотдавна — преди по-малко от 40 години.

10 септември 1983 г. Кари Мулис завършва първия етап от експеримента си над полимеразната верижна реакция (PCR — Polymerase Chain Reaction). Резултатът? Откриване дори на една единствена частица от вируса в дадена проба и възпроизводство на вирусната ДНК в неограничени количества! Смисълът? Огромен скок за молекулярната генетика! Без неговата технология проектът „Човешки геном“ едва ли би се осъществил в следващото столетие. Практически ползи? Създаването на нови видове лекарства за всичко – от антракс до малария и рак! Но вместо фанфари, Мулис е уволнен. Рецензентите не намират смисъл в откритието! Lexmedicanews припомня бурното житие на този изтъкнат учен.

Кой е Кари Мулис? 

Американски биохимик, носител на Нобелова награда по химия през 1993 г. за изобретяването на полимеразната верижна реакция. 

Роден е в Леноир, Северна Каролина, на 28 декември 1944 г. в семейството на фермер и домакиня. Детството му преминава в Колумбия, Южна Каролина. През 1966 г. завършва Технологическия институт в Джорджия. Но още преди да постъпи в университета експериментът бил в кръвта му. Затова си спечелва прозвището хулиган-отличник!

14-годишен се опитва да превърне захарта в космическо гориво. Смесва захарта с калиева селитра и… ракетата му прелетяла цяла миля!

В студентските години произвежда експлозиви в една от лабораториите на института и ги продава на миньорите. При това съвсем легално. В трети курс синтезира психотропни вещества. Всяка седмица студентите пробвали нещо ново. По-късно в интервю за списание ще си спомни: "Взимах доста LSD през 60-те и 70-те години. Но това правеха мнозина в Бъркли."

Позавъртял парички, той сменял гадже след гадже. Психотропните вещества, от които и той опитвал, развинтили фантазията му и Мулис започнал да развива космологични теории. После управлявал ресторант. След това решил да стане писател и наистина пише книга. Сменил няколко съпруги, но накрая се завърнал отново към биохимията. И когато му омръзнало да реже главите на плъховете, за да търси някакво вещество в мозъка им, той се захваща със синтез на ДНК в биотехнологичната корпорация „Ситес“. Ръководството на корпорацията му разрешава в 10% от работното време да се занимава с разработване на собствени теми. Мулис се интересувал и от компютри. През 1982 г. създал програма, която събирала данните от спектрометъра, за да завърши синтеза навреме. Свързвал работния компютър с персоналния вкъщи и следял реакциите от къщи. По това време, работейки по 80 часа седмично, Мулис създал първата апаратура за синтез на ДНК.

Освен биохимията жените са другата страст на Кари Мулис

По това време Мулис се замесил в скандал за носене на оръжие на работа, но му се разминало. Спасила го падащата цена на нефта. „Стандарт ойл“ поръчва на „Ситес“ да се създадат генно-модифицирани бактерии, които да преработват глюкозата във фруктоза. Но работите не тръгнали, както очаквали нефтените магнати, цената на петрола продължавала да пада, а разходите по технологията за рекомбинирането на ДНК  били непредвидени.

В „Ситес“ започнали съкращения. Разбира се, никой не смятал да съкращава Мулис, но съкращавали сътрудниците му, а той се нуждаел от тях. Трябвало да измисли нещо, за да ги запази.

И измислил.

Денят бил петък. Мулис пътувал към вилата си с новата си любовница, която кротко спяла в колата.

Знаел, че ако в ДНК на плода се открие мутация за сърповидноклетъчна анемия, то бременната имала право на аборт. „Ситес“ искали да разработят технология за генна диагностика и да я продават на клиниките. Методът струвал скъпо, отнемал време – почти три седмици, изисквал висококвалифицирани биохимици. Клетките от плода се присаждали на мишки и се следяло дали те боледуват.

На Мулис му бил нужен прибор, в който да се постави материала, да се натисне копчето и след два дни резултатът да бъде на лице.

И тогава на Мулис му хрумнало нещо: дали да не клонират in vitro, без мишки? При деленето на клетката ДНК се „разплита“ на две, но това може да се постигне и чрез денатурация — с просто загряване до 95 ⁰C, а полимеразата е тази, която копира ДНК в клетките. Това е отдавна известно на биохимиците. Ако към охладената денатурирана ДНК се прибави полимераза, ензимът копира ДНК. Така от две вериги ще се получат четири. А какво ли би станало, ако създаде компютърна програма, която да повтори процеса 10 пъти? 1024 копия! А 30 пъти? Това са 1 073 742 834 копия! При това без мишки!

Тук се налага да отворим една скоба и да си припомним уроците по биология. За завършилите образованието си през миналия век това вероятно дори е изцяло непозната материя.

Полимеразите са група от няколко ензима (а всички ензими са белтъци), които в живите клетки копират генетичната информация. Ако в думата съзирате “полимер”, това никак не е случайно — ДНК е всъщност най-големият и най-масовият естествен полимер в природата. Молекулата, която носи генетичната информация на всяко живо същество на планетата ни — от най-простите бактерии до върха на еволюцията — човекът, е съставена от само 4 градивни блока, които учените наричат бази или нуклеотиди: аденин, тимин, гуанин и цитозин. Тези 4 бази се комбинират по специфичен начин и кодират информацията за около 30 000 гена в човешкото тяло. Всеки ген съдържа рецептата за синтеза на определен белтък. Няма да сбъркаме, ако наречем ДНК “готварската книга” на клетката. Но ДНК е много повече от това.

Всеки път когато клетката се дели, тя първо удвоява генетичния си материал, т.е. ДНК. Процесът започна с разделяне на познатата ни двойна спирала, а след това ензимът полимераза започва да удвоява нишките, като използва за матрица единичните нишки. При човека копирането (учениге наричат процеса ДНК репликация) отнема приблизително 9 часа, защото ензимите трябва да навържат близо 6 500 000 нуклеотида по абсолютно същия начин, както в оригиналните нишки. Копието трябва да е съвършено! Всяка грешка създава мутация, която се пренася в следващите поколения клетки. А някои мутации водят до състояния, несъвместими с живота.

Биохимикът получава Нобелова награда за химия за 1993 г. за откриването и прилагането на метода PCR

Но да се върнем отново до идеята, която по-късно ще донесе на Мулис Нобела по химия за 1993 година. Той бързо схванал, че с помощта на метода може да се размножава каквато и да е ДНК! Ако в пробата има ДНК на бактерии и ние я копираме 1 073 742 834 пъти, то можем да разберем дали има инфекция. През двата дни на уикенда Мулис нахвърлил записките си. Съобщил идеята си на семинар, но никой не се запалил. Напротив, всички го убеждавали, че няма да проработи. Никой не искал да му сътрудничи. Тогава Мулис се оплакал на Рон Кук, който му бил направил машината за синтез на ДНК. Мулис му споделил, че възнамерява да работи върху идеята си в 10-те процента от работното си време. „Не го прави – посъветвал го Кук. – Не прави нищо, не оставяй записки. Уволни се, развий идеята и после я патентовай.“ Мулис не възприел идеята. Смятал, че ако тя проработи, работодателите му няма да го оставят на сухо. По-късно горчиво се смял на това.

На 9 септември 1983 г. Мулис сложил ДНК и полимераза в епруветката, но в следващите 36 часа нищо не се получило. Веригата ДНК била много дълга, а полимеразата – слаба. Опитал се да публикува идеята си в „Nature“ и „Science“, но престижните научни журнали не приели статията.

По-късно компанията „Ситес“ продала технологията за PCR за 330 000 000 долара, изплатила на Мулис 5 заплати и… го уволнила. Вече нямало кой да носи оръжие на работа, да извлича за яката в коридора колеги на „мъжки разговор“, да развива фантасмагорични идеи.

Технологията обаче оценили лекарите. Тя давала възможност да се открие всяка една инфекция по нищожно количество ДНК в пробата. Подобно нещо преди не съществувало.

Точно тогава светът изпада в паника заради новооткрития вирус на СПИН. Милиони хора изгубвали сън, докато не видят „отрицателен“ в резултатите си. И по този въпрос Мулис имал свое мнение. Той войнствено заявявал, че имунният дефицит не е само от т.н. вирус на СПИН, но и от други ретровируси. Влизал в ожесточени спорове и си навличал гнева на биолози специалисти по СПИН. “Ако има доказателство, че ХИВ предизвиква СПИН, трябва да има и научни документи, които демонстрират този факт с висока степен на вероятност. Но на света няма нито един подобен документ”, заявява ученият.

На 8 декември 1993 г. Кари Мулис получава Нобелова награда. Всички с притаен дъх очаквали словото му. Дали няма да оплюе предишните работодатели или да каже нещо ненаучно във връзка със собствените си теории за СПИН?

Но всичко минало тихо и кротко. С присъщото си чувство за хумор Мулис разсмял аудиторията и благодарил на всичките си бивши съпруги и приятелки, които белязали пътя му и стъпка по стъпка го довели до Нобеловата награда… 

Миналата година пневмония отне живота на забележителния учен. На 7 август той почина в Ню Порт Бийч, Калифорния.

Ученият е и запален сърфист


Полимеразна верижна реакция (PCR)

Понеже ДНК е микроскопична, много копия от нея трябва да са налични, преди да можем да я видим с невъоръжено око. Това е една от причините PCR да е толкова важен инструмент: произвежда достатъчно копия от една ДНК поредица, че да можем да видим или да манипулираме този регион ДНК.

Полимеразната верижна реакция е често използвана лабораторна техника, която се използва за създаване на много копия (милиони или милиарди!) от един специфичен ДНК регион. Този ДНК регион може да е всеки регион, от който се интересува изследователят. Например, може да е ген, чиято функция изследователят иска да разбере, или генетичен маркер, използван от криминолозите, за да се съпостави ДНК от местопрестъпление със заподозрените.

Обикновено целта на PCR е да се направят достатъчно копия от целевия ДНК регион, така че да могат да бъдат анализирани или използвани по друг начин. Например ДНК, увеличено от PCR, може да бъде изпратено за секвениране (разчитане на генома, т.е. определяне на поредицата нуклеотидни бази А, Т, Ц и Г в една част ДНК), визуализирано от гел електрофореза, или клонирано в плазмид за последващи експерименти.

PCR се използва в много области на биологията и медицината, включително молекулярно-биологични проучвания, медицинска диагностика и дори някои клонове на екологията.

Както ДНК репликацията в един организъм, PCR изисква ензима ДНК полимераза, който създава нови нишки ДНК, използвайки съществуващите нишки за модел. ДНК полимеразата, която обикновено се използва в PCR, се нарича Taq полимераза, наречена на издържащата на топлина бактерия, от която е била изолирана - Thermus aquaticus.

T. aquaticus живее в горещи потоци и хидротермални отдушници. Нейната ДНК полимераза е много топлинно-стабилна и е най-активна около 70°C (температура, при която човешка ДНК полимераза или такава на E. coli няма да е ефективна). Тази топлинна стабилност прави Taq полимеразата идеална за PCR. Висока температура се използва няколко пъти при PCR, за да денатурира ДНК модела или за да раздели нишките ѝ.

Ключовите съставки на една PCR реакция са Taq полимераза, праймери (къси парчета еднонишкова ДНК, които се прикрепят към шаблонното ДНК и действат като “стартери” за полимеразата), шаблонна ДНК и нуклеотиди (градивните блокове на ДНК). Съставките биват събрани в една епруветка, заедно с кофактори, които са необходими на ензима, и преминават през повтарящи се цикли на затопляне и охлаждане, които позволяват синтезирането на ДНК. Циклите се повтарят 25 - 35 пъти в една обикновена PCR реакция, което обикновено отнема 2-4 часа, в зависимост от дължината на копирания ДНК регион. Ако реакцията е ефикасна (работи добре), целевият регион може да премине от само едно или няколко копия към милиарди. Това е така понеже не само оригиналната ДНК се използва като шаблон всеки път. Вместо това новата ДНК, която е направена в един цикъл, може да служи като шаблон в следващия цикъл на ДНК синтез.

PCR се използва в много изследователски лаборатории и също има практически приложения в криминалистиката, генетичното изследване и диагностицирането. Например PCR се използва за увеличаване на гени, свързани с генетични разстройства от ДНК на пациенти (или от ДНК на фетуса в случая с пренаталното изследване). PCR може да бъде използвана за тест за бактерия или ДНК вирус в тялото на пациента: ако е наличен патоген, може да могат да се увеличат региони от неговата ДНК от кръвна или тъканна проба.

PCR методиката за откриването на новия коронавирус представлява директен тест за откриване на част от генома (РНК) на вируса и към момента е приет за “златен стандарт” в лабораторната диагностика на този патоген

В медицината полимеразната верижна реакция намира приложение в диагностичния процес на вирусни, бактериални, автоимунни, генетични, онкологични заболявания, токсични ефекти от прилагано лечение и др. Най-често PCR в областта на медицината се прилага при трудно лечимите вирусни заболявания, като хепатит B, C, D, СПИН (HIV) и др. Резултатът позволява да се отчете и проследи количеството на вируса, т.е. вирусния товар в човешкото тяло. Именно този товар е добър показател за това колко болен е човек и доколко ефективно е лечението. Информацията от теста позволява на лекарите да определят кога да се започне лечение и как пациентът реагира на него. Оттам може да се създаде индивидуален план на лечение според нуждите на пациента.